基于桿狀病毒的 AAV 生產(chǎn)
盡管已上市的第一個(gè) AAV 基因治療產(chǎn)品 uniQure 的 Glybera (alipogene tiparvovec) 是使用桿狀病毒系統(tǒng)生產(chǎn)的，但該平臺(tái)主要針對(duì)治療性蛋白質(zhì)的生產(chǎn)進(jìn)行了優(yōu)化。行業(yè)已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一種 BEVS 生產(chǎn)系統(tǒng)，用于生產(chǎn)規(guī)模為 21,000 L 的含有流感血凝素的疫苗。與基于 HEK293 的方法相比，桿狀病毒介導(dǎo)的 AAV 生產(chǎn)還不太成熟，盡管大約在二十年前就已首次引入，但臨床上的產(chǎn)品較少。與 AAV 等病毒載體相比，單一重組蛋白的生產(chǎn)復(fù)雜性較低，而對(duì)于前者，五種蛋白質(zhì)（VP1、VP2、VP3、Rep78 和 Rep52）和單鏈 DNA 分子必須以最佳水平表達(dá)并正確組裝。
最佳 AAV 生產(chǎn)需要將哺乳動(dòng)物病毒 (AAV) 分子翻譯到培養(yǎng)的昆蟲(chóng)細(xì)胞中。AAV 需要剪接才能正確表達(dá)其 VP1、VP2 和 VP3 衣殼蛋白及其 Rep78 和 Rep52 亞型。遺傳序列已經(jīng)進(jìn)化以確保最佳剪接并隨后AAV結(jié)構(gòu)成分在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的正確化學(xué)計(jì)量。不幸的是，這些過(guò)程并沒(méi)有在昆蟲(chóng)細(xì)胞中以最佳方式發(fā)生，除其它外，天然存在的病毒啟動(dòng)子需要被在桿狀病毒感染細(xì)胞中具有活性的啟動(dòng)子取代。因此，需要進(jìn)行分子修補(bǔ)，以確保生產(chǎn)完全包裝且有效的 AAV 顆粒。如果不對(duì)病毒基因進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆肿庸こ獭⒁苑侠ハx(chóng)細(xì)胞表達(dá)，所產(chǎn)生的病毒將呈現(xiàn)不正確的衣殼化學(xué)計(jì)量（通常存在過(guò)多的 VP1），并且完整衣殼的百分比將會(huì)很低。圖 3 中的示意圖描述了迄今為止不同代的桿狀病毒生產(chǎn)系統(tǒng)。
圖 3：基于桿狀病毒的 AAV 生產(chǎn)系統(tǒng)的歷史示意圖，第一個(gè)系統(tǒng)于 2002 年推出，其中包含三種桿狀病毒，分別包含目的轉(zhuǎn)基因、cap 基因和 rep 基因。cap 基因置于桿狀病毒多角體蛋白 (polH) 啟動(dòng)子的控制之下。rep 同種型 Rep52 和 Rep78 在 polH 啟動(dòng)子 (Rep52) 和 Orgyia pseudotsugata (OpMNPV) (Rep78) 的 Δ 立即早期 1 啟動(dòng)子的控制下分成兩個(gè)獨(dú)立的表達(dá)盒。第二代系統(tǒng)通過(guò) Smith和Chen等人描述的策略將 cap 和 rep 結(jié)合在單個(gè)桿狀病毒中。后來(lái)，Galibert 等人開(kāi)發(fā)了一個(gè) Monobac 系統(tǒng)，在單個(gè)桿狀病毒中包含所有三個(gè)元素（cap、rep 和轉(zhuǎn)基因）。Aslanidi等人后來(lái)開(kāi)發(fā)了穩(wěn)定表達(dá) cap 和 rep 基因的 Sf9 源性包裝細(xì)胞系。使用這些系統(tǒng)生產(chǎn) AAV 只需要感染一種表達(dá)轉(zhuǎn)基因的桿狀病毒。
在第一代 BEVS 中，rep 轉(zhuǎn)錄本在不同啟動(dòng)子的控制下被分成兩個(gè)盒，并且 cap 編碼序列被改變，以包含一個(gè)非規(guī)范的起始密碼子（ACG 而不是 AUG），以實(shí)現(xiàn)正確的 AAV 衣殼化學(xué)計(jì)量和基因組包裝。基因改變的 AAV 序列被克隆到三個(gè)單獨(dú)的桿狀病毒構(gòu)建體中，這些構(gòu)建體含有 cap、rep 或兩側(cè)為 AAV ITR 的轉(zhuǎn)基因。為了有效地生產(chǎn) AAV，單個(gè)細(xì)胞需要同時(shí)感染三種不同的桿狀病毒。雖然該“Three-Bac”系統(tǒng)成功應(yīng)用于重組AAV血清型1的生產(chǎn)，但無(wú)法應(yīng)用于其它AAV血清型的生產(chǎn)。
第二代 BEVS 克服了 AAV 血清型的限制，并將 AAV 生產(chǎn)所需的桿狀病毒數(shù)量減少到兩種：攜帶 cap 和 rep 基因的 Bac–CapRep 病毒和攜帶 AAV DNA 基因組的 Bac–Transgene。此外，引入了不同的分子適應(yīng)性，以實(shí)現(xiàn) AAV 基因的正確表達(dá)。例如，Kondratov 等人使用衰減 Kozak 序列和漏核糖體掃描來(lái)實(shí)現(xiàn) AAV5 和 AAV9 衣殼蛋白的正確化學(xué)計(jì)量。該團(tuán)隊(duì)重新設(shè)計(jì)的 AAV 載體比 HEK293 生產(chǎn)的載體表現(xiàn)出更高的生物學(xué)效能。
確保正確的 AAV 化學(xué)計(jì)量 - 從而以高產(chǎn)量生產(chǎn)有效載體的另一種策略是在 AAV 序列中插入人工內(nèi)含子。Chen等鑒定了一個(gè)桿狀病毒源性的內(nèi)含子，他們?cè)谄渲蟹胖昧藯U狀病毒多角體蛋白 (polh) 啟動(dòng)子。將人工內(nèi)含子引入 (AAV) rep 和 cap 基因，以增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄，從而增強(qiáng) VP2/3 和 Rep52 的表達(dá)水平。由此產(chǎn)生的 AAV（各種血清型）具有傳染性且滴度高（高達(dá) 10^14 vg/L）。
BEVS 系統(tǒng)的最新發(fā)展包括將 AAV 生產(chǎn)所需的重組桿狀病毒數(shù)量進(jìn)一步減少到只有一種重組病毒。Galibert等人通過(guò)將所有三個(gè) AAV 基因（rep、cap 和側(cè)翼為 AAV ITR 的轉(zhuǎn)基因）插入一個(gè)“Monobac”桿狀病毒中來(lái)實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。Aslanidi等人制備了桿狀病毒感染誘導(dǎo)型草地貪夜蛾 (Sf9) 包裝細(xì)胞系，細(xì)胞基因組中含有 AAV rep 和 cap 基因。用兩側(cè)攜帶有 AAV ITR 的轉(zhuǎn)基因的單個(gè)桿狀病毒感染該包裝細(xì)胞系，導(dǎo)致產(chǎn)生比第一代 Three-Bac 系統(tǒng)更高產(chǎn)量的 AAV 顆粒。
如果不對(duì) AAV 基因進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆肿庸こ?、以符合昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)，則產(chǎn)生的病毒將具有不正確的衣殼化學(xué)計(jì)量和較低百分比的完整衣殼。此外，不正確的 Rep52 和 Rep78 表達(dá)時(shí)間和水平將導(dǎo)致在 AAV 衣殼中包裝更多殘留（宿主和桿狀病毒）DNA。因此，在表征桿狀病毒生產(chǎn)系統(tǒng)的 AAV 顆粒時(shí)，了解使用哪種特定表達(dá)系統(tǒng)始終很重要。這極大地影響了 AAV 載體的特性，例如傳染性、效力、包裝和可生產(chǎn)性。
與 BEVS 相關(guān)的 AAV 生產(chǎn)的另一個(gè)挑戰(zhàn)是桿狀病毒載體本身固有的遺傳不穩(wěn)定性。桿狀病毒在病毒復(fù)制過(guò)程中自然切除其部分基因組，以形成突變病毒，這些病毒可能成為有缺陷的干擾顆粒。在后續(xù)需要擴(kuò)大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)傳代過(guò)程中，這些突變體的生長(zhǎng)速度可能超過(guò)具有全長(zhǎng)基因組的桿狀病毒。
與 AAV 基因表達(dá)和剪接不當(dāng)一樣，分子工程可以在很大程度上克服桿狀病毒遺傳不穩(wěn)定性。通過(guò)刪除某些基因或通過(guò)將轉(zhuǎn)基因插入基因組中特定的穩(wěn)定位點(diǎn)，可以使桿狀病毒基因組更加穩(wěn)定。此類策略尚未針對(duì) AAV 表達(dá)進(jìn)行充分探索。一旦桿狀病毒載體和 AAV 基因的分子設(shè)計(jì)得到優(yōu)化，生物生產(chǎn)商將受益于 BEVS 平臺(tái)的許多積極特性，以大規(guī)模、穩(wěn)健地生產(chǎn) GMP 級(jí)生物藥。
原文：F.Hoeksema, H.van der Schaar, P.Puri, et al., Large-Scale AAV Production: Advantages of an Insect-Cell Baculovirus Expression Vector Platform. Bioprocess Insider, 2023.
