根據(jù)研討會(huì)期間收集的信息，參與者指出的實(shí)施連續(xù)生物工藝HTPD的主要挑戰(zhàn)列于表 2。此外，參與者針對(duì)所討論的每個(gè)挑戰(zhàn)提出了可能的解決方案。建模和微/納米流體是這些領(lǐng)域進(jìn)一步投資/優(yōu)先考慮的主要建議，以便更輕松、更順利地過(guò)渡到連續(xù)生物生產(chǎn)。這些提議的解決方案和 ICB 中的其它當(dāng)前需求將被進(jìn)一步討論，特別關(guān)注 PAT 工具和單元操作的連接。
表 2 (a) 研討會(huì)參與者指出的主要問(wèn)題，以及針對(duì) ICB 工藝開發(fā)投資/優(yōu)先考慮的建議解決方案/領(lǐng)域；(b)參與者建議的工具摘要（只有六個(gè)小組回答了這個(gè)問(wèn)題）作為 ICB 中 HTPD 當(dāng)前差距/問(wèn)題的解決方案
過(guò)程分析技術(shù)
PAT 被定義為“通過(guò)及時(shí)測(cè)量（即在工藝過(guò)程中）原材料和過(guò)程中材料和工藝關(guān)鍵質(zhì)量和性能屬性來(lái)設(shè)計(jì)、分析和控制生產(chǎn)的系統(tǒng)，以確保最終產(chǎn)品質(zhì)量”。在生物制藥行業(yè)實(shí)施 PAT 的最終目標(biāo)是設(shè)計(jì)和開發(fā)易于理解的工藝，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)控原材料或過(guò)程中的產(chǎn)品屬性來(lái)控制工藝，從而可靠地確保最終產(chǎn)品的預(yù)定質(zhì)量，即關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）。PAT 框架提供的、清晰的過(guò)程控制和理解支持生物制藥行業(yè)采用質(zhì)量源于設(shè)計(jì) (QbD) 方法。QbD 被定義為“基于健全的科學(xué)和質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)管理，以預(yù)先確定的目標(biāo)開始，并強(qiáng)調(diào)對(duì)產(chǎn)品和工藝的理解以及過(guò)程控制的系統(tǒng)開發(fā)方法”。因此，PAT 實(shí)施將有助于這種系統(tǒng)化的工藝開發(fā)方法，通過(guò)提供對(duì)產(chǎn)品和工藝設(shè)計(jì)的更好理解，確保一致的產(chǎn)品質(zhì)量。
PAT 應(yīng)用在連續(xù)工藝中的關(guān)鍵要素是能夠收集 CQA 信息并觸發(fā)及時(shí)響應(yīng)，以促進(jìn)控制。分析測(cè)量必須在促進(jìn)實(shí)時(shí)決策所需的時(shí)間范圍內(nèi)可用。此外，為了輕松實(shí)施 PAT 工具，儀器所需的成本不應(yīng)該很高，至少在它不會(huì)大幅增加生物制藥生產(chǎn)成本之前是這樣。此外，選擇的分析技術(shù)必須精確、準(zhǔn)確和穩(wěn)健。雖然連續(xù)工藝可從 PAT 實(shí)施中獲得很多收益，但這些類型的工具還沒(méi)有被充分探索過(guò)，并且針對(duì)連續(xù)工藝的發(fā)展，傳感器技術(shù)、配置和穩(wěn)健性仍需要重大改進(jìn)。
關(guān)于上游工藝，經(jīng)典過(guò)程傳感器提供有關(guān)工藝變量的信息，例如溫度、pH、溶解氣體和泡沫水平。然而，涉及光譜傳感器的、更強(qiáng)大的技術(shù)已成功用于過(guò)程監(jiān)控。例如，近紅外光譜已被最廣泛地研究，以用于確定細(xì)胞培養(yǎng)液中單個(gè)成分的濃度，如 Arnold 等人所證明的那樣。此外，拉曼光譜不僅可用于分析培養(yǎng)液成分譜，還可以用于監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)/化學(xué)變化，尤其是用于在線監(jiān)測(cè)聚體形成或糖基化等質(zhì)量屬性。最近，基于液相色譜-質(zhì)譜的多屬性方法已成為一種重要的 PAT，允許同時(shí)監(jiān)測(cè)產(chǎn)品質(zhì)量屬性，如聚糖譜、電荷異構(gòu)體和生物治療藥物的純度。通過(guò)開發(fā)一個(gè)平臺(tái)，從生物反應(yīng)器中收集無(wú)細(xì)胞樣品，然后使用自動(dòng)液體處理系統(tǒng)進(jìn)行自動(dòng)高通量純化，Dong 等人（2016）證明可以產(chǎn)生“近乎實(shí)時(shí)”的測(cè)量，為使用此類技術(shù)在整個(gè)生物生產(chǎn)過(guò)程中監(jiān)測(cè)多個(gè) CQA 奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
對(duì)于下游工藝，PAT 的實(shí)施仍然相當(dāng)有限，部分原因是缺乏傳感器選項(xiàng)：pH、電導(dǎo)率、吸光度和壓力傳感器實(shí)際上并不能測(cè)量生物分子的質(zhì)量屬性，例如蛋白質(zhì)聚集。然而，Kamga 等人 (2013) 采用多波長(zhǎng)紫外光譜來(lái)有效地確定蛋白質(zhì)混合物中單個(gè)成分的濃度，準(zhǔn)確預(yù)測(cè)相對(duì)于目的蛋白質(zhì)的聚體濃度。此外，對(duì)于層析步驟，實(shí)施 PAT 可能具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)檫@些單元操作的典型工藝時(shí)間很短。Sharma等人 (2006) 證明，通過(guò)在線分析型 LC，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)層析步驟的連續(xù)監(jiān)測(cè)，以發(fā)現(xiàn)聚集峰。使用在線高效液相色譜 (HPLC) 系統(tǒng)研究工藝層析柱的實(shí)時(shí)合并，并對(duì)其編程，以在聚集峰開始時(shí)停止收集，結(jié)果顯示，使用 PAT，可促進(jìn)基于產(chǎn)品質(zhì)量屬性的層析柱合并的實(shí)時(shí)決策。
因此，在連續(xù)工藝中，PAT 工具必須為后續(xù)的工藝步驟在線提供決定性信息，從而使工藝的連續(xù)性成為可能。未來(lái)，這些 PAT 的開發(fā)和實(shí)施將允許設(shè)計(jì)生產(chǎn)工藝，從而提供一致的、明確定義的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品并提高工藝效率。可預(yù)見的挑戰(zhàn)包括實(shí)施非侵入過(guò)程監(jiān)測(cè)技術(shù)，以及將先進(jìn)傳感器整合到自動(dòng)化過(guò)程控制策略中。
數(shù)據(jù)采集/建模
生物技術(shù)行業(yè)中的生物工藝存在許多挑戰(zhàn)，并且通常不如其它行業(yè)那么簡(jiǎn)單。操作的復(fù)雜性，尤其是發(fā)酵的復(fù)雜性，使該行業(yè)多年來(lái)一直處于“試錯(cuò)-優(yōu)化”模式。然而，近年來(lái)，隨著 QbD 和 PAT 的應(yīng)用，人們對(duì)更好地理解這一工藝有了更大的推動(dòng)。這使科學(xué)家和工程師能夠?qū)γ總€(gè)操作擁有更多的知識(shí)和細(xì)節(jié)了解，而不是將工藝純粹視為“黑匣子”。將一個(gè)工藝（無(wú)論是發(fā)酵等相對(duì)復(fù)雜的過(guò)程，還是混合罐等更簡(jiǎn)單的過(guò)程）轉(zhuǎn)化為數(shù)學(xué)模型的能力不僅可以加深對(duì)工藝的理解，還可以減少優(yōu)化所需的時(shí)間和實(shí)驗(yàn)數(shù)量。機(jī)械模型 (MM) 旨在準(zhǔn)確描述要描述的系統(tǒng)的物理化學(xué)現(xiàn)象，并且行業(yè)已經(jīng)針對(duì)生物工藝發(fā)布了幾個(gè)此類模型的示例。除了純粹的機(jī)械模型之外，使用 MM 和機(jī)器學(xué)習(xí)的混合方法（如人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)）可以幫助減輕計(jì)算機(jī)上的計(jì)算負(fù)載，例如，通過(guò)使用數(shù)據(jù)集來(lái)確定某些參數(shù)，然后將其用作模型的輸入。這加速了工藝開發(fā)并提供了更快的結(jié)果，如文獻(xiàn)中所示，用于估計(jì)工藝參數(shù)和優(yōu)化整個(gè)下游工藝。一旦對(duì)此類模型進(jìn)行了調(diào)整和訓(xùn)練，這些計(jì)算的輸出將為工藝提供非常有價(jià)值的見解。很明顯，無(wú)論是在工藝開發(fā)階段還是在生產(chǎn)工廠中實(shí)施此類工藝后，模型對(duì)于向集成式連續(xù)生物生產(chǎn)的飛躍都非常重要。然而，建模不能完全脫離實(shí)驗(yàn)工作和數(shù)據(jù)。它需要數(shù)據(jù)來(lái)估計(jì)參數(shù)、訓(xùn)練模型并最終驗(yàn)證它們。此外，數(shù)學(xué)模型對(duì)于急需的控制策略的實(shí)施和實(shí)現(xiàn)非常重要，這對(duì)于確保如此復(fù)雜的生產(chǎn)線的正常運(yùn)行至關(guān)重要。
模型的使用現(xiàn)在被工業(yè)界廣泛接受，并且肯定是未來(lái)連續(xù)工藝的一個(gè)關(guān)鍵特征。行業(yè)需要能夠根據(jù)基于準(zhǔn)確描述的模型對(duì)工藝的意外變化做出動(dòng)態(tài)決策的能力。這也提出了對(duì)可靠和準(zhǔn)確數(shù)據(jù)收集的需求。再加上日益改進(jìn)的傳感器，非常需要快速且準(zhǔn)確的分析，不僅收集有關(guān)工藝行為的數(shù)據(jù)，以便快速采取行動(dòng)，而且能夠監(jiān)測(cè)和控制 CQA，并維護(hù)最終產(chǎn)品質(zhì)量。考慮到生產(chǎn)工廠中發(fā)生的所有單元操作和過(guò)程，生成的數(shù)據(jù)量可能是巨大的。盡管生成的大量數(shù)據(jù)對(duì)于工藝?yán)斫夂捅O(jiān)控至關(guān)重要，但數(shù)據(jù)分析的自動(dòng)化也同樣至關(guān)重要。集成式連續(xù)生物生產(chǎn)倡議渴望找到方法來(lái)容納和充分利用所有生成的數(shù)據(jù)，無(wú)論是用于工藝控制、工藝概覽還是工藝開發(fā)。
上游/下游工藝連接
對(duì)于真正集成的連續(xù)生物生產(chǎn)，連續(xù)單元操作（上游和下游）的不間斷連接是必要的，它們之間沒(méi)有或很少發(fā)生隔離的中間性保持步驟。
行業(yè)已經(jīng)建立了幾個(gè)將連續(xù)上游工藝與捕獲步驟相結(jié)合的例子，使用灌流培養(yǎng)技術(shù)從生物反應(yīng)器中連續(xù)去除培養(yǎng)基和細(xì)胞外產(chǎn)物。整合這兩個(gè)工藝步驟的一個(gè)主要挑戰(zhàn)是使上游灌流流速與下游純化流速同步。上游和下游系統(tǒng)之間的同步控制系統(tǒng)目前也較缺乏。因此，下游系統(tǒng)（前饋控制）不會(huì)檢測(cè)到上游工藝的偏差，反之亦然（反饋控制）。這種類型的系統(tǒng)需要進(jìn)一步的開發(fā)和測(cè)試，因?yàn)槎鄠€(gè)上游參數(shù)會(huì)影響后續(xù)的下游操作。Karst等人證明了通過(guò)安裝近線 HPLC 來(lái)實(shí)施反饋控制的可能性，以提供生物反應(yīng)器收獲液的滴度數(shù)據(jù)，以調(diào)節(jié)捕獲步驟的操作條件并通過(guò)使用控制回路調(diào)節(jié)連續(xù)體積流速。
盡管連續(xù)上游生物工藝已經(jīng)相當(dāng)完善，但完全連續(xù)的下游工藝的整合仍然是一個(gè)待開發(fā)領(lǐng)域。對(duì)于連續(xù)捕獲和精純層析，可以應(yīng)用兩個(gè)主要系統(tǒng)：周期性逆流層析 (PCC) 和模擬移動(dòng)床層析。在真正集成的連續(xù)層析平臺(tái)中，可以通過(guò)調(diào)節(jié)層析柱中的保留時(shí)間超過(guò)連續(xù)的柱步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)工藝同步。為確保來(lái)自一根層析柱的劣質(zhì)洗脫液材料不會(huì)與下一個(gè)功能性層析柱的材料混合，需要實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和反饋控制。柱之間的合并也可能引入交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，而反饋控制策略可能能夠檢測(cè)到流出液并將流出液從第二根柱轉(zhuǎn)移。
Gomis-Fons等人（2019）在小規(guī)模條件下開發(fā)了不同層析柱和用于純化重組蛋白的超濾單元之間的連接。外部控制器 Orbit 用于使系統(tǒng)自動(dòng)化，并應(yīng)用了開環(huán)和閉環(huán)控制策略：例如，入線監(jiān)測(cè) UV，并使用基于吸光度水平的自動(dòng)產(chǎn)品合并。此外，在集成的連續(xù)下游工藝中，耗材需求（如層析填料和緩沖液消耗）的顯著減少將導(dǎo)致運(yùn)營(yíng)成本的大幅降低。Gjoka等人 (2017) 將4個(gè)純化單元操作轉(zhuǎn)換為連續(xù)工藝，與相應(yīng)的批次工藝過(guò)程相比，分別減少了 95% 和 44% 以上所需的填料和緩沖液體積，并顯著降低了耗材消耗。因此，一個(gè)完全集成的連續(xù)工藝有可能優(yōu)化質(zhì)量、成本、速度和靈活性，最緊迫的挑戰(zhàn)是為整個(gè)生物生產(chǎn)過(guò)程創(chuàng)建一個(gè)全局性的監(jiān)測(cè)和控制策略。這不僅需要監(jiān)測(cè)和控制所有入口和出口液流的連續(xù)測(cè)量（PAT 框架），還需要可現(xiàn)實(shí)的反饋和前饋控制策略，以確保最終產(chǎn)品質(zhì)量。到目前為止，據(jù)作者所知，生產(chǎn)過(guò)程中的完整端到端集成仍有待開發(fā)。然而，Godawat 等人(2015) 已能夠?qū)⒐嗔魃锓磻?yīng)器與兩個(gè)周期性 PCC 單元相結(jié)合，用于初始捕獲和連續(xù)的離子交換步驟，表明創(chuàng)建完全集成的端到端連續(xù)生物工藝平臺(tái)是可行的。最近，Coolbaugh 等人（2021）通過(guò)在中試規(guī)模上進(jìn)行的成功概念證明，證明了這種端到端的連續(xù)工藝是可放大的。
其它需求
前文所述需求代表了需要進(jìn)一步開發(fā)的三大領(lǐng)域。然而，也有一些需求完全沒(méi)有得到關(guān)注，而另一些需求盡管沒(méi)有完全被忽視，但仍然缺乏作為可靠解決方案的實(shí)用和/或可負(fù)擔(dān)的技術(shù)。高通量篩選 (HTS) 日益普及，導(dǎo)致世界各地的工廠采用更自動(dòng)化的實(shí)驗(yàn)室和小型化分析。長(zhǎng)期以來(lái)，自動(dòng)化液體處理系統(tǒng)的使用已被確立為 HTPD 在下游（主要是層析）中的標(biāo)準(zhǔn)，已經(jīng)有報(bào)道描述了測(cè)定吸附等溫線甚至完整層析運(yùn)行的方法。使用此類設(shè)備可以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的自動(dòng)化，同時(shí)保持低使用量，從而實(shí)現(xiàn)更快、更具成本效益的分析。對(duì)于上游來(lái)說(shuō)，HTPD 已經(jīng)有了解決方案，但是，這些解決方案通常帶有非常高的價(jià)格標(biāo)簽，例如 Ambr?系統(tǒng)，這可能會(huì)阻礙科學(xué)家和行業(yè)公司對(duì)此進(jìn)行的投資。因此，該行業(yè)正在呼吁尋找負(fù)擔(dān)得起的替代品，并認(rèn)為微流體是滿足這一需求的好機(jī)會(huì)。在細(xì)胞系開發(fā)方面，目前對(duì)于沒(méi)有 Ambr? 系統(tǒng)的公司來(lái)說(shuō)，最先進(jìn)的技術(shù)是以批次模式獲取性能更好的細(xì)胞株，然后在灌流模式下對(duì)其進(jìn)行測(cè)試。因此，需要對(duì)細(xì)胞生物學(xué)有更深入的了解，這最終將推動(dòng)以可承受的價(jià)格開發(fā)出更好的細(xì)胞系，而微流控技術(shù)將提供這一點(diǎn)。
微流控已被證明是一種強(qiáng)大的規(guī)?？s小模型，能夠模擬多個(gè)單元操作，其優(yōu)勢(shì)在于使用更少的樣本量并實(shí)現(xiàn)更快的分析。這些設(shè)備仍需要為在工藝開發(fā)中的應(yīng)用鋪平道路，但在結(jié)晶、層析、細(xì)胞培養(yǎng)、水雙相系統(tǒng)、生物催化等不同的單元操作中已經(jīng)顯示出有希望的結(jié)果，并且已作為 HTS 設(shè)備的有希望的縮小模型。然而，過(guò)濾仍缺乏允許實(shí)現(xiàn)特定單元操作 HTPD 的規(guī)?？s小模型。膜過(guò)濾在微流體中也沒(méi)有廣泛使用。液體處理站對(duì)這種單元操作的 HTPD 的適應(yīng)仍處于非常早期的階段。過(guò)濾工藝開發(fā)通常需要大量的材料和耗時(shí)的工作。在這樣的系統(tǒng)中使用 HTS 設(shè)備可減少工藝開發(fā)中的試劑消耗，同時(shí)避免設(shè)備尺寸過(guò)大，后者往往是工藝了解較差的結(jié)果。
結(jié)論
向連續(xù)工藝的轉(zhuǎn)變是成熟行業(yè)的自然路徑，生物制藥行業(yè)正在其它行業(yè)的步伐，技術(shù)進(jìn)步越來(lái)越多地推動(dòng)了這種轉(zhuǎn)變。這項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是巨大的，并且得到了很好的證明，即其可以在不同的規(guī)模上降低工藝成本，即使在不同的生產(chǎn)規(guī)模條件下，與最成熟的批次模式相比，也是如此。
通常，連續(xù)工藝允許實(shí)現(xiàn)更高效的工藝，同時(shí)降低占用空間。由于設(shè)備的使用效率更高，增加體積流速意味著連續(xù)工藝的設(shè)備和耗材成本的增加比批次工藝中觀察到的要小。與連續(xù)生物工藝相對(duì)應(yīng)的是對(duì)快速分析和控制的需求增加，這可以對(duì)操作條件的波動(dòng)提供實(shí)時(shí)響應(yīng)，以保證產(chǎn)品質(zhì)量。
盡管過(guò)去 20 年的技術(shù)突破是巨大的，但我們可以理解，學(xué)術(shù)界和工業(yè)界都渴望更好的工藝技術(shù)。從研討會(huì)的結(jié)果可以得出結(jié)論，雖然工藝開發(fā)和優(yōu)化有很多選擇，但改進(jìn)的空間仍然很大，要么擁有新技術(shù)，要么找到降低現(xiàn)有技術(shù)價(jià)格的方法，以使工藝開發(fā)“民主化”。被認(rèn)為最有希望填補(bǔ) ICB 當(dāng)前空白的工具包括建模和微/納米流體。這符合監(jiān)管機(jī)構(gòu)在 PAT 和 QbD 倡議中的當(dāng)前要求，其中更高的過(guò)程理解是為了實(shí)現(xiàn)對(duì)最終產(chǎn)品質(zhì)量的控制，從而降低產(chǎn)品差異，滿足CQA。
上游和下游工藝研究的最新進(jìn)展允許實(shí)現(xiàn)以連續(xù)模式運(yùn)行具有競(jìng)爭(zhēng)力的單元操作，從而使這些新工藝優(yōu)于先前建立的工藝。由于多年來(lái)上游和下游工藝是分開開發(fā)的，現(xiàn)在的挑戰(zhàn)在于將所有這些單元操作集成到一個(gè)連續(xù)的端到端生產(chǎn)過(guò)程中。軟件和硬件的集成對(duì)于實(shí)現(xiàn)完全連續(xù)的工藝流程以及前饋和反饋的工藝控制非常重要，以便根據(jù)其它單元操作中發(fā)生的情況做出更快的決策。PAT 的進(jìn)一步發(fā)展和控制系統(tǒng)的同步化將是生物制藥行業(yè)向端到端連續(xù)工藝轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵推動(dòng)力。
縮短上市時(shí)間通常會(huì)阻礙連續(xù)工藝的實(shí)施，因?yàn)楦菀住鞍踩惺隆辈⒋_保“贏得比賽”。然而，生物仿制藥可以利用專利到期并押注這種工藝模式，旨在實(shí)現(xiàn)更高效、更便宜的工藝，使生物仿制藥生產(chǎn)公司能夠與其它參與者競(jìng)爭(zhēng)。
原文：M.N.Sao Pedro, T.C.Silva, R.Patil, et al., White paper on high‐throughput process development for integrated continuous biomanufacturing. Biotechnology and Bioengineering, 2021, DOI: 10.1002/bit.27757.
