小型設(shè)備可實現(xiàn)快速開發(fā)和優(yōu)化，雖然有許多設(shè)備用于補料分批培養(yǎng)，但幾乎沒有可用于高細胞密度灌流培養(yǎng)的設(shè)備。為了彌補這一差距，在 mL 級微孔板中開發(fā)了偽灌流方法，能夠?qū)崿F(xiàn)灌流培養(yǎng)的許多特定特征，包括高細胞密度、細胞截留以及提高生產(chǎn)力。在每天 1-2 次培養(yǎng)基置換之前，通過沉淀或離心 24 孔微孔板實現(xiàn)假灌流，產(chǎn)生高于 90% 的分離效率。培養(yǎng)基置換在第 3 天開始，達到每天 0.5-1.8 個罐體積 (VVD) 的灌流率。偽灌流方法實現(xiàn)最大活細胞密度 (VCD) 高達 42 × 10^6 cells/mL，比補料分批培養(yǎng)高 4.2 倍。體積生產(chǎn)率增加了 1.9 倍，產(chǎn)生了與工業(yè)水平相關(guān)的生產(chǎn)率。在沉降法和離心法之間觀察到類似的性能，當使用沉降法時，由于操作時間延長和分離前細胞密度降低而導致的微小偏差。微孔板 (MWP) 實驗在 5 L 規(guī)模下進行了驗證，并顯示出代謝物和生長曲線的可比性。這項工作展示了一種用于高通量開發(fā)研究的強大工具，該工具對培養(yǎng)基成分和置換率的變化很敏感，可以可靠地用于高細胞密度灌流培養(yǎng)的初步篩選。
簡介
隨著單克隆抗體 (mAb) 等治療性蛋白質(zhì)的生產(chǎn)規(guī)模越來越大，行業(yè)正在轉(zhuǎn)向連續(xù)工藝，以提高效率。灌流培養(yǎng)方法的實施提供了更高的生產(chǎn)率、更小的設(shè)施占地面積和更低的商品成本，但該技術(shù)的廣泛采用受到批次失敗的高風險和設(shè)置的復雜性的阻礙。與補料分批相比，最近的技術(shù)進步降低了失敗率，提高了灌流培養(yǎng)的生產(chǎn)率并減少了批次間的可變性。此外，長期穩(wěn)態(tài)灌流培養(yǎng)操作可確保產(chǎn)品質(zhì)量始終如一，這促使監(jiān)管機構(gòu)提出了推動實施連續(xù)生物生產(chǎn)的舉措。
有人提出，灌流培養(yǎng)方法的成功取決于降低灌流速率的能力，理想情況下降至每天 1 個罐體積 (VVD) 以下。這確保了使用最少的液體吞吐量實現(xiàn)高滴度，從而降低了運營成本。為了降低灌流速率，必須仔細選擇細胞系，并優(yōu)化培養(yǎng)基，以確保適當?shù)臓I養(yǎng)深度和滲透壓。使用高通量 mL 規(guī)模設(shè)備提供了選擇性能最佳的細胞系并通過并行運行實驗進行培養(yǎng)基研究的可能性，從而減少了與早期開發(fā)相關(guān)的時間尺度和成本。雖然微孔板和微型生物反應器等設(shè)備已廣泛用于補料分批培養(yǎng)，但灌流培養(yǎng)的等效平臺仍在開發(fā)中。由于灌流操作需要優(yōu)化多個過程參數(shù)，因此在 L 級規(guī)模臺式生物反應器中執(zhí)行時，這可能是資源密集型和低通量的。作為替代方案，通常使用搖瓶、搖管或微孔板中的偽灌流。
這些偽灌流系統(tǒng)的幾個例子之前已經(jīng)被描述過，將“離散”的培養(yǎng)基置換和細胞截留整合到用于 CHO 細胞培養(yǎng)的預先存在的補料分批工藝中。示例包括搖瓶、離心管和mL級生物反應器。偽灌流搖瓶已達到 70 × 10^6 cells/mL 的細胞密度。然而，搖瓶是勞動密集型的，并且它們的操作難以自動化，而自動化在篩選 100 種條件時是非?？扇〉牟呗浴u管的工作體積通常在 10 到 50 mL 之間，并以 220 到 320 rpm 之間的速度 N 搖動。細胞分離是通過在培養(yǎng)基交換之前離心來實現(xiàn)的，在工作體積的 40% 和 100% 之間變化。Villiger-Oberbek 等人報告活細胞密度高達 50 × 10^6 cells/mL，而 Karst 等人維持 15 × 10^6 cells/mL 的穩(wěn)定相培養(yǎng)以進行動態(tài)代謝分析。已報道使用 ambr15? 模擬灌流培養(yǎng)，利用沉淀作為細胞截留機制或采用恒化器模式。沉降方法需要 40-60 分鐘的時間，以允許細胞沉降，其中包括在去除上清液和每天最多 8 次在培養(yǎng)基添加之前臨時關(guān)閉 pH、DO 和攪拌器控制。然而，在沉淀過程中長時間關(guān)閉控制可能會導致 pH 值和 DO 峰值，隨著培養(yǎng)的進行，對細胞健康有害。恒化器模式包括脈沖培養(yǎng)基添加，無需任何細胞截留步驟，同時保持恒定體積。據(jù)報道，活細胞密度高達 20 × 10^5 cells/mL，雖然周期性培養(yǎng)基置換可以被認為是模擬灌流方法中大量培養(yǎng)基置換的基礎(chǔ)，但這種方法受限于沒有細胞截留步驟。此外，ambr250? 可用于模擬灌流培養(yǎng)，但這可能涉及大量購買和運營成本。到目前為止提出的所有方法的工作體積都在 10 到 250 mL 之間，但是，為了進行初步篩選和優(yōu)化研究，工作體積更低的平臺將允許以更低的成本進行高通量實驗。
微孔板經(jīng)常用于批次和補料分批細胞培養(yǎng)的高通量開發(fā)研究。與搖瓶、搖管和微型生物反應器相比，其有可能顯著降低運營成本，并大大提高實驗通量。使用板蓋可最大限度地減少蒸發(fā)，同時最大限度地提高氧轉(zhuǎn)移率，這意味著微孔培養(yǎng)能夠在無菌環(huán)境中長時間維持。微孔板依賴于頂空氧氣轉(zhuǎn)移，振蕩速度和表面積與體積比被確定為最大化氧氣轉(zhuǎn)移的重要影響因素，即影響氣液傳質(zhì)系數(shù) kLa。雖然 kLa 隨著振蕩頻率的增加而增加，但可能會達到臨界振蕩速度，在該速度下可能會觀察到對細胞培養(yǎng)的不利影響。據(jù)報道，5-55 hr-1 的 kLa 支持高達 10^8 cells/mL，據(jù)報道，24 孔板的 kLa 為 12 hr-1，填充體積為 1 mL，以 225 rpm 的速度搖動并覆蓋具有透氣膜。因此，已公布的微孔板 kLa 值表明氧氣不會成為細胞密度高于 10^7 時 CHO 細胞生長的限制因素。
Huang等在工作體積為 3 mL 的 24 孔板中開發(fā)了一種方法，其中細胞以目標細胞密度接種，介于 20 和 30 × 10^6 cells/mL 之間。在他們的工作中，使用 100% 的工作體積通過每日離心和培養(yǎng)基置換來維持恒定的細胞密度。穩(wěn)定培養(yǎng)的研究表明是代謝分析的有用工具，但是穩(wěn)定相的分析僅限制了選擇性能最佳的細胞克隆和培養(yǎng)基的能力。在這項工作中，描述了微孔板中偽灌流方法的開發(fā)，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)生物反應器灌流培養(yǎng)的特征，即細胞截留能力、高細胞密度和提高的生產(chǎn)力。兩種關(guān)鍵的細胞截留方法，沉淀和離心，已經(jīng)以微孔板形式開發(fā)并與培養(yǎng)步驟相結(jié)合，以允許對每種方法作為競爭性選項進行比較和嚴格評估。
詳細的試驗方法、結(jié)果與討論，請參考原文。
圖 1. 補料分批、沉降和離心培養(yǎng)的性能比較，使用添加有 5%、15%、30% 和 45% EfficientFeed? B v/v 的培養(yǎng)基進行置換。在 1 VVD 條件下，補料分批培養(yǎng)和沉淀培養(yǎng) 的(A) VCD（實心方塊）和活性趨勢（空心方塊）。(B) 補料分批培養(yǎng)和離心培養(yǎng)的 VCD（實心方塊）和活性（空心方塊）。(C) 沉淀培養(yǎng)的分離效率。(D) 離心培養(yǎng)物的分離效率。
圖 2. 補料分批培養(yǎng)和沉降以及離心偽灌流培養(yǎng)的單位體積生產(chǎn)率比較，使用添加有 5%、15%、30% 或 45% EfficientFeed? B 的培養(yǎng)基進行置換。
圖 3. 沉降和離心培養(yǎng)物的性能比較，使用添加有 15% EfficientFeed? B v/v 的培養(yǎng)基，分別以 0.5、0.75、1.5 和 1.8 VVD 進行置換，(A) 沉淀培養(yǎng)的VCD（實心方塊）和活性趨勢， (B) 離心培養(yǎng)的 VCD（實心方塊）和活性趨勢（空心方塊）。(C) 沉淀培養(yǎng)的分離效率。(D) 離心培養(yǎng)的分離效率。1.8 VVD 未進行沉降測試，因為每天兩次的最大交換體積為 75%。
圖 4. 沉淀和離心偽灌流培養(yǎng)的單位體積生產(chǎn)率比較，使用添加了 15% EfficientFeed? B 的培養(yǎng)基進行置換，置換率為 0.5、0.75、1.5 和 1.8 VVD。這些值代表培養(yǎng)期間單位體積生產(chǎn)率的平均值。由于每天兩次的最大置換體積為 75%，因此未對 1.8 VVD 的灌流速率進行沉降測試。
圖 5. MWP 偽灌流方法與 5 L 灌流生物反應器的比較 (A) VCD 生長曲線（實心方塊）和相關(guān)細胞活性（空心方塊）(B) 葡萄糖濃度 (C) 乳酸濃度和 (D) mAb濃度。
總結(jié)
與補料分批培養(yǎng)相比，在微孔板中開發(fā)了一種偽灌流方法，該方法結(jié)合了細胞截留能力并產(chǎn)生更高的細胞密度和單位體積生產(chǎn)率。沉淀和離心方法具有相似的培養(yǎng)性能，但由于在沉淀培養(yǎng)中分離之前更長的操作時間和較低的累積細胞密度而存在微小偏差。偽灌流方法被證明對培養(yǎng)基成分的變化很敏感，這使得該系統(tǒng)有望用于灌流培養(yǎng)的早期開發(fā)。在分析的所有條件下，使用偽灌流方法延長至第 9 天的培養(yǎng)中達到的最高 VCD 比補料分批操作高 3.3-4.2 倍。1.5 和 1.8 VVD 的更高灌流速率以及更高的 CSPR，在 0.05 和 0.06 nL/cell/day 之間，產(chǎn)生的單位體積生產(chǎn)率比補料分批高 1.9 倍，并且提高微孔板中的偽灌流方法能夠模仿灌流培養(yǎng)的許多具體特征，與之前報道的偽灌流技術(shù)相比，體積減少了 8 倍。一組選定的工藝參數(shù)（即 1VVD）被轉(zhuǎn)移到 5L 灌流生物反應器中，顯示出可比較的細胞生長和生產(chǎn)力結(jié)果。微孔板中的偽灌流方法是用于灌流培養(yǎng)早期開發(fā)和篩選的強大、高通量工具。將該系統(tǒng)集成到自動液體處理設(shè)備中可以進一步擴展功能，提高可靠性和一致性。
原文：M. Tregidgo, C. Lucas, M. Dorn, et al., Development of mL-scale pseudo-perfusion methodologies for high-throughput early phase development studies. Biochemical Engineering Journal, 2023.
