rAAV 的生產(chǎn)是一個(gè)復(fù)雜的生物過(guò)程
重組腺相關(guān)病毒 (rAAV) 已成為體內(nèi)基因治療的首選載體。這些載體可用于轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的游離基因維持和轉(zhuǎn)基因表達(dá)。重組 AAV 是一種無(wú)復(fù)制能力的病毒載體，可通過(guò)以下幾種方法之一產(chǎn)生：昆蟲細(xì)胞的桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞基于輔助病毒（如單純皰疹病毒）的轉(zhuǎn)染以及或哺乳動(dòng)物細(xì)胞的三質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。最近，穩(wěn)定的生產(chǎn)細(xì)胞系變得更加受人關(guān)注，例如 CEVEC/Cytiva 的 ELEVECTA 平臺(tái)，因?yàn)檫@些平臺(tái)具有可放大性并減少了質(zhì)粒 DNA 等昂貴原材料的需求量。此外，也存在質(zhì)粒 DNA 的替代品：“狗骨”DNA (dbDNA) 是一種合成 DNA 載體，使用酶促 DNA 制造工藝生產(chǎn)，完全不需要微生物培養(yǎng)。
使用質(zhì)粒 DNA 對(duì)懸浮馴化的 HEK293 細(xì)胞進(jìn)行三質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染是生產(chǎn) AAV 的最常用方法之一。此過(guò)程不依賴于輔助病毒，質(zhì)粒 (pHelper) 提供必要的輔助元件。目的基因位于兩個(gè)反向末端重復(fù) (ITR) 序列 (pGOI) 和提供復(fù)制和衣殼蛋白 (pRepCap) 的第三個(gè)質(zhì)粒之間的單獨(dú)質(zhì)粒上。HEK293 細(xì)胞系由于易于培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染而被廣泛使用，它也是一種表征良好的細(xì)胞系，自 1977 年細(xì)胞系永生化以來(lái)一直用于生產(chǎn)重組蛋白。HEK293 細(xì)胞還穩(wěn)定表達(dá)腺病毒 E1A 和E1B，兩者都是 AAV 復(fù)制所必需的。
轉(zhuǎn)染試劑，如聚乙烯亞胺 (PEI) ，有助于質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞。PEI 與質(zhì)粒 DNA 形成復(fù)合物，并在與細(xì)胞孵育期間通過(guò)靜電相互作用與細(xì)胞膜結(jié)合。這些復(fù)合物然后通過(guò)胞吞作用以核內(nèi)體的形式內(nèi)化。核內(nèi)體必須通過(guò)微管相互作用通過(guò)細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)，避免溶酶體降解，直到質(zhì)粒 DNA 從核內(nèi)體逃逸到細(xì)胞質(zhì)中，然后必須通過(guò)核孔復(fù)合體 (NPC) 進(jìn)入細(xì)胞核。DNA 進(jìn)入細(xì)胞核取決于細(xì)胞周期，有人建議接近 M 期的轉(zhuǎn)染是理想的，因?yàn)楹四て屏芽梢栽黾淤|(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞核。
三質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的優(yōu)化工作已實(shí)現(xiàn)了收獲后滴度增加，但對(duì)于全身給藥藥物的生產(chǎn)，目前的滴度仍然不夠，因?yàn)榭赡苄枰^(guò) 10^15vg/患者的劑量。最簡(jiǎn)單的方法是擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，以滿足行業(yè)需求，但這會(huì)對(duì)本已昂貴的療法的商品成本產(chǎn)生巨大影響。在轉(zhuǎn)染優(yōu)化之前可以采取一些步驟來(lái)優(yōu)化生產(chǎn)過(guò)程，其中最基本的是選擇和開發(fā)合適的細(xì)胞系。細(xì)胞系選擇將決定貼壁或懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的上游工藝。一旦選擇，就可以進(jìn)行進(jìn)一步的開發(fā)，例如對(duì)高性能克隆的克隆篩選。細(xì)胞系工程也可用于敲入或敲除特定基因以提高細(xì)胞系性能。質(zhì)粒工程也可以在這一點(diǎn)上進(jìn)行，以增加生產(chǎn)的完整衣殼的比例。質(zhì)粒工程的潛在目標(biāo)可能包括修改 ITR 以增加完整的目的基因 (GOI) 包裹，或修改 Rep 蛋白以嘗試增加 GOI 的基因組復(fù)制和包裝。
基于 HEK293 的系統(tǒng)的一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)是確保正確轉(zhuǎn)染。據(jù)報(bào)道，只有 5-10% 的細(xì)胞似乎會(huì)產(chǎn)生可測(cè)量水平的 AAV 衣殼，這表明確保將每種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到每個(gè)細(xì)胞中可能是一個(gè)需要克服的障礙。這也可能是由抗病毒和炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)引起的，據(jù)報(bào)道這是對(duì)宿主細(xì)胞中 rAAV 產(chǎn)生的反應(yīng)，通過(guò)降低或消除細(xì)胞對(duì)病毒產(chǎn)生的反應(yīng)能力來(lái)影響這些途徑也可能提供增加病毒滴度的機(jī)會(huì)。在細(xì)胞培養(yǎng)物中添加小分子抑制劑可以實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，盡管可能需要在下游工藝 (DSP) 過(guò)程中去除這些小分子、或通過(guò)細(xì)胞系工程來(lái)敲除或敲低相關(guān)通路時(shí)產(chǎn)生問(wèn)題。
隨著規(guī)模的增加，轉(zhuǎn)染過(guò)程變得更具挑戰(zhàn)性，由于病毒載體生產(chǎn)設(shè)施越來(lái)越頻繁地設(shè)計(jì)為大于或等于 2000 L 的規(guī)模，這一點(diǎn)變得越來(lái)越重要。
DoE 與 OFAT 方法
優(yōu)化轉(zhuǎn)染的一個(gè)關(guān)鍵步驟是確定過(guò)程中的關(guān)鍵因素。從轉(zhuǎn)染試劑、質(zhì)粒、細(xì)胞系和復(fù)合介質(zhì)等原材料，到復(fù)合時(shí)間、質(zhì)粒比例和所用 DNA 總量等因素，這些因素各不相同。在更大的規(guī)模下，其它因素開始發(fā)揮作用，例如轉(zhuǎn)染混合物在反應(yīng)容器內(nèi)的分散所需的時(shí)間和效率。在初始工藝開發(fā)活動(dòng)中可能不會(huì)考慮這些因素，因?yàn)檫@些工作通常以小得多的量進(jìn)行。它們還會(huì)受到反應(yīng)器形狀、體積以及葉輪形狀和速度等變量的影響。
如上所述，影響 rAAV 生產(chǎn)轉(zhuǎn)染效率的因素有很多。一個(gè)常見的優(yōu)化過(guò)程是一次修改一個(gè)因素 (OFAT) - 但是，這這沒有考慮正在研究的因素之間的相互作用。Zhao等報(bào)道，OFAT 方法提高了某一血清型 rAAV 的產(chǎn)量，但在生產(chǎn)其它血清型時(shí)未觀察到這種增加。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) (DoE) 是一種已成功用于優(yōu)化整個(gè)生物技術(shù)行業(yè)流程的方法。DoE 允許對(duì)指定輸出的多個(gè)相互依賴的因素進(jìn)行評(píng)估。2020年，Zhao 等人首次報(bào)道了使用 DoE 優(yōu)化 AAV 載體生產(chǎn)。質(zhì)粒比率、總 DNA 濃度和細(xì)胞密度在 52 種不同條件下同時(shí)變化，導(dǎo)致 13 種不同衣殼變體的平均純化后產(chǎn)量超過(guò) 1×10^14 vg/L。諸如此類的結(jié)果可以用作進(jìn)入管線的新項(xiàng)目或產(chǎn)品的優(yōu)秀基準(zhǔn)，因此在這些情況下，減少工藝開發(fā)可能是可以接受的，而無(wú)需從第一原則開始重復(fù)完整的 DoE 流程。
使用 DoE 優(yōu)化轉(zhuǎn)染通常會(huì)涉及幾輪實(shí)驗(yàn)。第一輪可能會(huì)查看更大范圍的幾個(gè)變量，例如轉(zhuǎn)染時(shí)的活細(xì)胞密度、DNA 濃度、轉(zhuǎn)染試劑：DNA 比率、轉(zhuǎn)染體積和復(fù)合物形成的孵育時(shí)間。在此之后，可能會(huì)進(jìn)行另一個(gè) DoE 以進(jìn)一步細(xì)化這些因素，或者可能會(huì)引入新的變量，例如質(zhì)粒比率。在引入新的原材料、評(píng)估新的轉(zhuǎn)染試劑或使用新的細(xì)胞系時(shí)，有必要重復(fù)這些 DoE。
近年來(lái)，已經(jīng)投入了更多資源來(lái)了解 AAV 生產(chǎn)的基本原理，包括野生型和重組型。已經(jīng)有文章回顧了生產(chǎn) AAV 的 HEK293 細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)，并有文章總結(jié)了 AAV 產(chǎn)生的細(xì)胞途徑和動(dòng)力學(xué)，以及通過(guò)三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HEK293 細(xì)胞開發(fā) rAAV 生產(chǎn)的機(jī)制模型。這種對(duì)細(xì)胞過(guò)程和動(dòng)力學(xué)的更深入理解允許更有針對(duì)性的工藝優(yōu)化。這方面的一個(gè)例子是利用 PEI 介導(dǎo)的質(zhì)粒 DNA 傳遞的機(jī)制模型，該模型表明只有 5% 的質(zhì)粒輸入進(jìn)入細(xì)胞，而進(jìn)入細(xì)胞核的量甚至更小，約為 0.6%。這些數(shù)字可能因細(xì)胞系和轉(zhuǎn)染試劑而異，但確實(shí)提供了在嘗試優(yōu)化瞬時(shí)表達(dá)工藝中最關(guān)鍵的部分時(shí)需要克服的障礙。
優(yōu)化轉(zhuǎn)染是關(guān)鍵步驟，但不是唯一步驟
使用基于質(zhì)粒的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，優(yōu)化的轉(zhuǎn)染工藝對(duì)于確保最佳產(chǎn)量、質(zhì)量和一致性至關(guān)重要。將所有必需的質(zhì)粒 DNA 輸送到細(xì)胞核的過(guò)程是成功開發(fā)高產(chǎn)生產(chǎn)平臺(tái)的基礎(chǔ)。
為了最大限度地提高生產(chǎn)率，還需要評(píng)估其它因素。這些范圍從細(xì)胞系開發(fā)、細(xì)胞系的組學(xué)評(píng)估以確定基因敲除或敲低的目標(biāo)，以及質(zhì)粒工程以最大化完整衣殼，到生產(chǎn)過(guò)程中的培養(yǎng)基成分和補(bǔ)液策略以優(yōu)化細(xì)胞健康和生產(chǎn)力。所有這些因素和許多其它因素都有助于生產(chǎn)過(guò)程足以滿足當(dāng)前一代基因療法開發(fā)的需要。
原文：P. Boyce, Transfection optimization for AAV production. Cell & Gene Therapy Insights 2023; 9(3), 305–309.
