大規(guī)模 AAV 生產(chǎn)
大規(guī)模生產(chǎn)和商業(yè)化生產(chǎn)需要特定的細胞系特性，例如可放大性和高產(chǎn)量。細胞需要在低成本、無血清的培養(yǎng)基中生長，系統(tǒng)應該符合純度和安全的監(jiān)管要求。傳統(tǒng)上，基于懸浮的生產(chǎn)是在體積高達 50,000 L 的可重復使用不銹鋼生物反應器 (STR) 或 15 mL - 2,000 L 規(guī)模的一次性 STR 中進行的。STR 非常靈活，可提供廣泛的潛在操作條件以及基于充分理解的混合原理的高效氣體傳輸。
搖擺式生物反應器也可用于規(guī)模高達 500 L 的懸浮培養(yǎng)。與 STR 不同，這些系統(tǒng)的可放大性有限，因為它們僅使用頂空通氣，但系統(tǒng)易于操作。例如，可實現(xiàn)的體積可用于中等規(guī)模的生產(chǎn)，作為大規(guī)模細胞生產(chǎn)的種子擴增系列的一部分，以及用于生產(chǎn)（輔助）病毒種子儲備。這種懸浮培養(yǎng)中的細胞基質(zhì)在數(shù)千升的批次生產(chǎn)中顯示出遺傳穩(wěn)定性。
STR 中達到的細胞密度取決于細胞類型和培養(yǎng)基，但對于沒有細胞截留的批次培養(yǎng)，通常范圍在 5 - 20 × 10^6 cells/mL 之間。適用于 STR 和搖擺系統(tǒng)的灌流模式培養(yǎng)技術可以通過將細胞維持在最佳代謝狀態(tài)來增加細胞密度。例如，通過在線生物量測量和灌流速率控制，中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞的密度已達到 100 × 10^6 cells/mL。為了保持活性生物量，生物反應器必須配備截留裝置，使其能夠以灌流模式運行培養(yǎng)。
如此高的細胞密度有助于在產(chǎn)品生產(chǎn)開始之前縮短細胞擴增軌跡。以更快的速度達到這些密度可以減少 GMP 生產(chǎn)設施內(nèi)用于細胞擴增所需的時間和材料。此外，在基于病毒感染的生產(chǎn)系統(tǒng)中支持高細胞密度的能力為基于感染時細胞密度增加的工藝優(yōu)化和強化創(chuàng)造了機會。如果工藝工程師能夠保持細胞特異性生產(chǎn)率，那么感染時這種更高的密度將提供更高的單位體積生產(chǎn)率。
昆蟲細胞和懸浮馴化的 HEK293 細胞等懸浮細胞系可以在搖擺式反應器和攪拌罐反應器中使用無血清、化學成分確定的培養(yǎng)基生長，使其適用于 AAV 的大規(guī)模生產(chǎn)和商業(yè)化生產(chǎn)。Merten 對不同上游 AAV 生產(chǎn)系統(tǒng)的輸出進行了全面的、基于文獻的比較，并得出結(jié)論，血清型和載體結(jié)構(gòu)的差異阻礙了真正的比較 - 但原則上，不同的生產(chǎn)系統(tǒng)都可以實現(xiàn) 5 × 10^13 至 2.4 × 10^14 vg/L。然而，使用基于 HEK293 轉(zhuǎn)染的工藝需要大量昂貴（高質(zhì)量、符合 GMP 標準）的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑。
在 2019 年的一份成本比較報告中，Cameau 等人顯示每克質(zhì)粒 DNA 的成本為100,000 美元（定價基于 GMP 級質(zhì)粒的大批量訂單）。在他們的模型中，作者假設在 HEK293 懸浮培養(yǎng)中轉(zhuǎn)染 10^6 cells以生產(chǎn) AAV，需要 1.5 μg 質(zhì)粒 DNA，在 10^6 cells/mL 的轉(zhuǎn)染密度下，每生產(chǎn) 2,000 L，質(zhì)粒 DNA 需要投資 300,000 美元。用于病毒載體生產(chǎn)的、廣泛使用的基于 HEK293 的瞬時轉(zhuǎn)染工藝很容易在實驗室規(guī)模上執(zhí)行，但其具有挑戰(zhàn)性的過程控制和可變性可能會在放大過程中造成困難。
BEVS 生產(chǎn)系統(tǒng)已經(jīng)使用了幾十年，從傳統(tǒng)的研究工具發(fā)展成為獸藥產(chǎn)品的生產(chǎn)系統(tǒng)，然后是用于生產(chǎn)人類治療藥物的生產(chǎn)技術。使用該系統(tǒng)的昆蟲細胞生產(chǎn)了多種供人類使用的許可疫苗和療法。其中包括 uniQure 的 Glybera 療法，它在 2012 年成為第一個獲得上市許可的基因療法，以及 2021 年的 COVID-19 疫苗。這樣的記錄證明，如果桿狀病毒在多個傳代中針對遺傳穩(wěn)定性進行了優(yōu)化，那么真正的BEVS 生產(chǎn)系統(tǒng)可以實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。
例如，源于 S. frugiperda 的細胞系 - Protein Sciences Corporation 的 expressSF+ 細胞系 - 已被用于 Flublok 生產(chǎn)過程中的快速高效放大。有了它，公司在 2-L、10-L、100-L、650-L 和 2,500-L 規(guī)模上實現(xiàn)了相同的工藝性能，然后進一步擴大到 21,000-L 生產(chǎn)工藝。BEVS 使用標準化和完全表征的桿狀病毒種子庫來實現(xiàn)一致的上游生產(chǎn)。與 HEK293 轉(zhuǎn)染工藝相比，Sf9 細胞的感染不需要仔細的混合控制。在生產(chǎn)過程中，攜帶產(chǎn)生重組 AAV 載體所需基因的桿狀病毒被添加到生產(chǎn)生物反應器中以感染 Sf9 細胞培養(yǎng)。該方法最大限度地減少了對培養(yǎng)系統(tǒng)的負面影響（來自治療性轉(zhuǎn)基因的表達），因為 AAV 載體中通常使用的哺乳動物啟動子在昆蟲細胞中很少或沒有表達。
與 AAV 生產(chǎn)相關的挑戰(zhàn)包括生產(chǎn)過程的穩(wěn)健性低、AAV 滴度的高可變性以及含基因組顆粒的百分比低/可變。上游工藝的一致性對于使下游生產(chǎn)工藝能夠提供正確且一致的產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量至關重要。AAV 的大規(guī)模生產(chǎn)必須去除無法有效放大的下游技術：例如，離心和梯度超速離心。過濾和層析技術是優(yōu)選。
AAV 生產(chǎn)下游工藝的一個關鍵挑戰(zhàn)是解決和控制空衣殼和完整衣殼的混合物，空衣殼被認為是工藝相關雜質(zhì)。為此，重要的是在上游產(chǎn)生盡可能高的完整/空衣殼比，從而簡化隨后使用離子交換層析 (IEX) 在下游工藝中去除空衣殼的過程。它根據(jù)顆粒凈表面電荷的相應差異來分離顆粒，對于 AAV，凈表面電荷根據(jù)其等電點 (pI) 和環(huán)境 pH 值可以是正、中或負的。可以使用多種層析載體，包括膜層析（例如 Pall 的 Mustang S 型）、固定整體柱形式的對流相互作用介質(zhì)（來自 Sartorius BIA Separations 的 CIM）或基于顆粒的吸附層析（Cytiva 的 Sepharose 填料和 Thermo Fisher Scientific 的 POROS介質(zhì)）。
許多 AAV 血清型的 pI 已經(jīng)確定，完整 AAV 衣殼的 pI 略低于空衣殼，因為衣殼結(jié)構(gòu)中的 DNA 帶負電荷。盡管 pI 值差異很小，但 IEX 可以通過優(yōu)化的洗脫條件將它們分離?；?IEX 的工藝是可重復的，可以自動化并適應滿足工業(yè)生產(chǎn)需求的大規(guī)模操作。然而，通常需要對 IEX 方法進行實質(zhì)性開發(fā)，因為分離空顆粒和完整顆粒的條件取決于它們在衣殼和包殼病毒基因組之間的物理化學相互作用。
AAV 生產(chǎn)的監(jiān)管注意事項
基因治療開發(fā)人員非常感興趣的是加速批準途徑。美國食品和藥物管理局 (FDA) 的加速批準范例可以近似為四年時間框架，而不是產(chǎn)品批準的典型 10-11 年 - 如果許可申請的化學、制造和控制 (CMC) 部分足夠穩(wěn)健，并且如果精心設計的早期臨床研究已證明其有效性。對于希望利用這種范例的公司，必須投資于商業(yè)就緒生產(chǎn)平臺的早期開發(fā)，這些平臺使用可以迅速擴大到商業(yè)生產(chǎn)的工藝，盡快為 CMC 文件包生成可靠的數(shù)據(jù)。
盡管 BEVS 平臺需要在時間和資源上進行前期投資，來生產(chǎn)和表征高質(zhì)量的桿狀病毒種子庫，但可通過快速和線性的放大軌跡來平衡這一點，并在工藝和其生物起始材料方面保持一致。在臨床開發(fā)或大規(guī)模 GMP 生產(chǎn)期間對基于 BEVS 的生物生產(chǎn)工藝進行重大變更是一種潛在的策略，可能會帶來重大的技術和監(jiān)管挑戰(zhàn)并延遲項目。從一個高效、穩(wěn)健和可放大的生產(chǎn)平臺開始，開發(fā)具有成本效益的生產(chǎn)工藝對于滿足未來的治療需求將變得越來越重要。
商品成本是關鍵
據(jù)估計，到 2025 年全球基因治療市場價值將超過 100 億美元。這種增長提供的機會導致開發(fā)用于臨床應用的 AAV 載體的公司數(shù)量顯著增加，正在進行的 AAV 臨床試驗超過 250 項。對臨床前和臨床病毒載體生產(chǎn)能力的需求正在增加，以支持越來越多的基因治療開發(fā)項目。下一代 AAV 生產(chǎn)系統(tǒng)將需要生產(chǎn)足夠數(shù)量的治療載體。每個生物生產(chǎn)商都應謹慎選擇能夠滿足其自身臨床和商業(yè)需求的生產(chǎn)系統(tǒng)。
基于轉(zhuǎn)染的生產(chǎn)平臺將為相對低劑量的孤兒病適應癥提供足夠的產(chǎn)量（例如，Luxturna 治療眼?。?。然而，隨著基因治療領域轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€為更多患者群體服務的行業(yè)，其載體需要系統(tǒng)給藥，以應對越來越多的疾病適應癥，生產(chǎn)能力估計需要增加一到兩個數(shù)量級。
一旦 BEVS 在分子和工藝水平上得到適當設計，昆蟲細胞系統(tǒng)就具有明顯的潛力，可以提供具有有利商品成本 (CoG) 的先進 AAV 生產(chǎn)系統(tǒng)。這將有助于該行業(yè)解決對病毒載體不斷增長的需求。
原文：F.Hoeksema, H.van der Schaar, P.Puri, et al., Large-Scale AAV Production: Advantages of an Insect-Cell Baculovirus Expression Vector Platform. Bioprocess Insider, 2023.
