灌流系統(tǒng)的穩(wěn)健放大需要所有規(guī)模的可比條件，以確保同等的細(xì)胞培養(yǎng)性能。當(dāng)連續(xù)工藝中的細(xì)胞在生物反應(yīng)器外部循環(huán)時，如果射流和攪拌導(dǎo)致灌流進(jìn)樣和返回之間直接連接，則可能會出現(xiàn)性能損失。計算流體動力學(xué)可用于識別此類短路流、評估混合效率并最終調(diào)整灌流設(shè)置。本研究調(diào)查了從 2 L 玻璃生物反應(yīng)器到 100 L 和 500 L 一次性中試規(guī)模系統(tǒng)的規(guī)模放大。高分辨率的格子玻爾茲曼大渦（Lattice Boltzmann Large Eddy）模擬在單相中進(jìn)行，混合效率 (Emix) 進(jìn)一步在 2 L 系統(tǒng)中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。該評估可以深入了解生物反應(yīng)器內(nèi)的流動模式、混合行為和細(xì)胞停留時間的信息。由于在所有測試條件下 Emix 均大于 90%，因此中試規(guī)模系統(tǒng)無需進(jìn)行幾何調(diào)整。在 2 L 規(guī)模下評估了兩種不同的設(shè)置，其中流動方向發(fā)生變化，混合效率相差 10%。盡管如此，由于確認(rèn) 2 L 設(shè)置的 Emix 也 >90%，并且所有規(guī)模的確定混合時間都在相似的范圍內(nèi)，因此 2 L 系統(tǒng)被認(rèn)為是合適的縮小模型。結(jié)果證明了計算流體動力學(xué)模型如何用于生物制藥行業(yè)強(qiáng)化生產(chǎn)過程的合理工藝設(shè)計。
人口的快速增長、疾病患病率的增加以及生物制藥知識和接受度的不斷提高迫使生物制藥公司優(yōu)化工藝。特別是過去幾年對單克隆抗體（mAb）的需求有所增加。大多數(shù)單克隆抗體在中國倉鼠卵巢 (CHO) 細(xì)胞中生產(chǎn)，并采用補(bǔ)料分批工藝作為首選工藝策略。然而，對更高產(chǎn)品產(chǎn)量的需求鼓勵了強(qiáng)化工藝策略的開發(fā)。因此，灌流工藝已成為即將推出的、利用細(xì)胞截留來提供更高細(xì)胞密度的生產(chǎn)技術(shù)的重要組成部分。最常見的技術(shù)，如切向流過濾 (TFF) 或交替式切向流 (ATF) 系統(tǒng)，都涉及中空纖維，用于將細(xì)胞繞回到生物反應(yīng)器中，同時不斷置換培養(yǎng)基。作為 N 階段灌流或傳統(tǒng)補(bǔ)料分批工藝的替代方案，生產(chǎn)力較低的生長階段也可以轉(zhuǎn)移到前階段，從而在 N 階段實(shí)現(xiàn)更高的單位體積生產(chǎn)力。通過這種強(qiáng)化補(bǔ)料分批策略，與低密度種子培養(yǎng)相比，滴度幾乎翻倍。
不利的一面是，灌流模式也面臨著挑戰(zhàn)。除了技術(shù)復(fù)雜的設(shè)置增加了污染風(fēng)險之外，高細(xì)胞密度還導(dǎo)致生物反應(yīng)器中的粘度升高，從而降低混合效率。此外，噴射流和攪拌的組合可能會引起灌流進(jìn)樣和回流液流之間的直接連接，從而導(dǎo)致短路流的形成。因此，混合在高細(xì)胞密度培養(yǎng)中非常重要?；旌喜涣嫉姆磻?yīng)器會導(dǎo)致細(xì)胞環(huán)境中的局部異質(zhì)性，例如底物濃度、pH、DO 和 CO2 梯度。因此，生物反應(yīng)器的整體性能可能會因極端 pH 值、DO 或底物濃度供應(yīng)不足而導(dǎo)致細(xì)胞活性下降，進(jìn)而受到損害。其后果是產(chǎn)品滴度降低以及產(chǎn)品質(zhì)量超出規(guī)格。
在過去的十年中，計算流體動力學(xué) (CFD) 已用于生物制藥環(huán)境中的多種應(yīng)用或混合應(yīng)用。示例性用例包括在微量滴定板中建立 kLa 模型、對冷凍容器中的熱和質(zhì)量傳輸（包括相變）進(jìn)行建模以及優(yōu)化UF/DF 工藝，包括混合效率評估。 Radoniqi 等人之前對 ATF 組件進(jìn)行了數(shù)值流模擬。然而，他們的研究重點(diǎn)是中空纖維的內(nèi)腔和膜污染的闡明，而不是罐內(nèi)的混合性能。
一般來說，如果需要瞬態(tài)方法，傳統(tǒng)的模擬方案在計算成本和時間方面可能非常昂貴。涉及格子玻爾茲曼大渦模擬 (LBLES) 的有前途的模擬方法在圖形處理單元 (GPU) 上并行時可加速高分辨率瞬態(tài)模擬。它們對于混合研究的有效性已在多項(xiàng)研究中得到證明。與以數(shù)值方式近似求解宏觀納維-斯托克斯（Navier-Stokes）和能量方程的傳統(tǒng) CFD 方法不同，格子玻爾茲曼方法 (LBM) 在介觀尺度上描述流域中的粒子行為。基于 LBM 的 CFD 工具（例如 M-Star）可對格子玻爾茲曼方程 (LBE) 進(jìn)行數(shù)值求解。因此，所有必要的宏觀流動變量都可以通過使用粒子分布函數(shù)和守恒定律來計算，以恢復(fù)宏觀方程，例如納維-斯托克斯方程。與其它方法相比，LBM 方法更適合具有復(fù)雜邊界的模擬。除此之外，LBM 方法運(yùn)行速度更快，因?yàn)?LBE 可以通過僅考慮線性流和碰撞過程來計算，而不是構(gòu)造宏觀連續(xù)方程，其中發(fā)生高階計算。因此，這種方法特別適合描述連續(xù)灌流過程中存在的復(fù)雜混合現(xiàn)象的瞬態(tài)行為。
在這項(xiàng)工作中，目的是表征不同規(guī)模的灌流生物反應(yīng)器的混合性能，以降低工藝失敗的風(fēng)險。最初，對 2 L 規(guī)?？s小灌流反應(yīng)器進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)隨后用于驗(yàn)證從格子玻爾茲曼方法 (LBM) CFD 模擬中檢索到的混合效率。此外，還對100 L和500 L中試規(guī)模進(jìn)行了模擬研究。除了混合效率外，還確定了流動模式和細(xì)胞停留時間，支持對不同規(guī)模的灌流系統(tǒng)的評估。
詳細(xì)實(shí)驗(yàn)操作和結(jié)果，請參考原文。
圖 1. 反應(yīng)器裝置 (A)，實(shí)驗(yàn)裝置示意圖 (B)。
圖 2. 稀釋率測定示例。葉輪速度為 250 rpm 時測得的電導(dǎo)率信號 (A)，對數(shù)濃度 (B)。
圖 3. 2 L 灌流罐的模擬和測量混合效率比較。 (A) 設(shè)置 I，(B) 設(shè)置 II。
圖 4. 設(shè)置 I 的 2 L 生物反應(yīng)器在不同功率輸入 (A) 10 W/m3、(B) 27 W/m3 和 (C) 58 W/m3 下的流線。以橙色向前計算的流線為流入，以藍(lán)色向后計算的流線為流出。表面顏色表示渦流的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。
圖 5. 設(shè)置 II 的 2 L 生物反應(yīng)器在不同功率輸入 (A) 10 W/m3、(B) 27 W/m3 和 (C) 58 W/m3 下的流線。以橙色向前計算的流線為流入，以藍(lán)色向后計算的流線為流出。表面顏色表示渦流的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。
圖 6. 100 L (A) 和 500 L (B) 灌流生物反應(yīng)器中的流線。以橙色向前計算的流線為流入，以藍(lán)色向后計算的流線為流出。表面顏色表示渦流的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。
圖 7. 2 L、100 L 和 500 L 灌流系統(tǒng)的混合效率比較。
圖 8. 2 L、100 L 和 500 L 灌流系統(tǒng)的混合時間 t95 比較。
圖 9. 2 L、100 L 和 500 L 灌流系統(tǒng)的停留時間分布比較。
總結(jié)
確定混合效率和防止短路流動是灌流系統(tǒng)表征和優(yōu)化的重要組成部分。為了確保穩(wěn)健的工藝性能，此類標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)在不同規(guī)模之間保持不變。格子玻爾茲曼大渦模擬已被證明是能夠進(jìn)行高分辨率瞬態(tài)模擬的有價值的工具。本研究展示了通過 LBLES 評估混合效率及其在 2 L 實(shí)驗(yàn)室規(guī)模灌流反應(yīng)器中的驗(yàn)證。模擬與實(shí)驗(yàn)之間的差異低于 5%，但兩種反應(yīng)器設(shè)置和多個功率輸入的差異為 8%。
通過模擬灌流反應(yīng)器中細(xì)胞的流動模式、混合效率、混合時間和停留時間分布，研究了放大到 100 L 和 500 L 中試規(guī)模的情況。在所有情況下，混合效率均達(dá)到>90%。因此，不需要對反應(yīng)器系統(tǒng)進(jìn)行幾何改造。考慮到檢查的標(biāo)準(zhǔn)，2 L 系統(tǒng)被證明是適合中試規(guī)模灌流的規(guī)?？s小模型。設(shè)置 II 的結(jié)果稍微更好地匹配中試規(guī)模性能，但是，兩個實(shí)驗(yàn)室規(guī)模反應(yīng)器設(shè)置的差異被認(rèn)為是不重要的?？傊?，建議在放大灌流工藝中采用這種 LBLES 方法作為風(fēng)險緩解措施，以防止短路流導(dǎo)致的工藝失敗。由于本研究僅包括單相模擬，因此未來的工作應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注多相系統(tǒng)。如果考慮氣相，流動模式會有所不同，可能會導(dǎo)致混合時間和效率的改變。最終，所有模擬結(jié)果都必須通過細(xì)胞培養(yǎng)來證實(shí)。
原文：M.Kuschel, J.Wutz, M.Salli, et al., CFD supported scale up of perfusion bioreactors in biopharma. Front. Chem. Eng., 2023.
